熒光的原理是某些物質會在高強度的短波長光線照射下，會發出波長稍長的發射光（熒光）。而我們一般都是觀察被激發熒光基團所發射出來的波長稍長的發射光（熒光）。

　　但是激發的光會很強，所以我們就需要把激發的光全部濾去，這樣才可以看到熒光基團的發射光（熒光）。

　　熒光顯微鏡一般都用高強度的汞燈做激發光源。使用濾色片把不需要的光濾去，只留下激發熒光集團的高強度很純的光線。這個單色的光線通過物鏡照射到樣本上之后，樣本會被激發出發射光（熒光），熒光和激發光都會沿著物鏡光路返回，這樣的話，就需要用一個二相色鏡把激發光濾去，只讓我們需要看到的熒光透過。

　　這個熒光沿著顯微鏡的光路最后到達目鏡下，然后進入我們的眼睛，我們就可以看到熒光基團所發出來的熒光了。

　　熒光顯微鏡的預檢查和調節：

　　(1)每次進行熒光觀測前，必須例行檢查熒光裝置的燈絲對中、光路對焦、孔徑光闌、視場光闌設置等狀況。

　　(2)所需要的熒光激發/發射濾光片組件是否已裝在轉換器中，熒光顯微鏡物鏡配置是否得當，除去物鏡前透鏡的油漬和灰塵。

　　(3)如同時進行透射光相差觀察，要檢查聚光鏡對中心及相差環與物鏡相反的共軛情況。

　　(4)檢查樣品載體(載玻片、蓋玻片和其他器皿)有否掛有液體、灰塵，厚度是否在物鏡標定的工作距離范圍內。切片樣品不能太厚，約≤10μm為宜。

　　(5)因照明光源含有紫外線，在載物臺前上方放一塊棕色遮光板，以防紫外線損傷視網膜。

　　(6)電壓不穩會降低高壓汞燈的使用壽命，光源電源加配穩壓器。

　　(7)為延長汞燈壽命，在開啟后15min方可關閉；汞燈熒光電源一旦關閉，再次啟動至少需等待10min，以使水銀蒸汽冷卻復至原態，否則會影響燈的壽命。

　　熒光顯微鏡的像觀察：

　　(1)在開啟熒光燈源后約5～10min激發光強度趨于穩定，裝載樣品進行觀察；為防止在調焦和尋找物像過程中過度激發光照會造成樣品熒光淬滅，先通過縮小熒光顯微鏡的孔徑光闌或加ND濾光片將激發光調節到適度強度，有規律地移動樣品臺，待確定鏡像后，在調節到熒光狀態用于拍攝記錄。

　　(2)鏡像質量不佳的調整。排除樣品制備因素外，可進行的必要調節措施是：

　　①排除成像光路中的遮光或限光器件，如DIC附件、ND濾光片等。

　　②重新調節熒光顯微鏡的收光器對焦和孔徑光闌大小。

　　③細心調節熒光顯微鏡物鏡覆蓋差校正環。

　　熒光顯微鏡的應用要點

　　熒光顯微鏡是利用“光化熒光”成像，如果所選激發波長在肉眼所看不見的近紫外光區(320～400nm)，熒光的發射光譜也較普通光鏡光源的平均波長短，光學分辨率提高。高能量的光子與電子碰撞，使得電子從基態躍遷到激發態。激發態的電子很不穩定，會重新回落到基態，這個過程中會消耗部分熱能，并發出新的光子。新的光子能量比起初的光子能量低，因此波長更長。由于新的光子波長區別于入射光的光子波長，通過一定的光學處理方法將兩束不同波長的光分開，從而使我們只看到發射出來的新光子（熒光信號），也就是熒光顯微鏡看到的熒光圖像。

標簽:                                    熒光顯微鏡