多聚甲醛固定后，白細(xì)胞的免疫表型通常會(huì)有所變化。而且，在固定之后，對(duì)細(xì)胞表面 Marker 的熒光穩(wěn)定性也會(huì)產(chǎn)生很大影響。為了獲得不同表面 Marker 的熒光穩(wěn)定性，了解固定后細(xì)胞的光散射特性和射門以及固定細(xì)胞后產(chǎn)生自發(fā)熒光是非常必要的。

在固定細(xì)胞 0、2、4、6、24、48、96 h  后，用 FITC 標(biāo)記抗體對(duì)全血進(jìn)行染色測(cè)定。通過檢測(cè)可溶性熒光素當(dāng)量分子 (MESF) 來定量分析熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示出，固定作用 48 h 后，細(xì)胞大小（FSC）和細(xì)胞顆粒度 (SSC) 能夠引起顯著的下降，在單核細(xì)胞中，固定作用 96 h 后，自發(fā)熒光急劇增加，是固定前的 9 倍。

從自發(fā)熒光的來看：未染色的樣本在固定之后上機(jī)檢測(cè)顯示，熒光強(qiáng)度相比固定之前有所增強(qiáng)，自發(fā)熒光被糾正后，固定前樣本間沒有明顯的區(qū)。在細(xì)胞固定后，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞的自發(fā)熒光持續(xù)增加，96 h 達(dá)到最高點(diǎn)。判斷熒光標(biāo)記的穩(wěn)定性之前要先進(jìn)行自發(fā)熒光的校正。

大體上來講，細(xì)胞固定后 48 h，細(xì)胞大小（FSC）發(fā)生明顯降低，但到了 96 h 后則基本保持不變。在淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞均發(fā)生同樣的變化。同樣的，SSC 在某種程度上也出現(xiàn)降低的特點(diǎn)。

文獻(xiàn)中 Denny 稱：在固定 1、24 h、48 h 后，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度說明抗體與細(xì)胞結(jié)合能力是發(fā)生了一些變化。在固定 24 h 后，CD3、CD19 有明顯增加，而 CD4、CD8、CD16 則沒有明顯改變。在固定 48 h 后，CD3、CD4、CD19 急劇增加，使用固定后洗滌的方式，不同的表面抗原也有不同的改變，CD4、CD8、CD19 是穩(wěn)定的，沒有發(fā)生顯著變化，而 CD3 的熒光強(qiáng)度卻發(fā)生降低。

兩種可能引起熒光強(qiáng)度衰退的原因：

1.NaN3；經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，樣本固定在 1%PFA 的 PBS（不含 NaN3）中，標(biāo)記抗體的熒光強(qiáng)度并未發(fā)生顯著的變化。

2. 固定的時(shí)間；經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，在固定 30 min 后，用 PBS（含 NaN3）重懸細(xì)胞后，自發(fā)熒光增加較為平緩。而在進(jìn)行自發(fā)熒光校準(zhǔn)之后，標(biāo)記抗體的熒光強(qiáng)度沒有影響。 隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)，粒細(xì)胞的大小（FSC）和顆粒度 (SSC) 都有明顯的降低。而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞都被粒細(xì)胞覆蓋上，對(duì)射門來講都是非常困難的。

參考文獻(xiàn)： Changes in Fluorescence Intensity of Selected Leukocyte Surface Markers Following Fixation； Judith C.Stewart；Michelle L.Villasmil ；Mark W.Frampton 等。